苯酚硫酸法 内容物为颗粒状时

多糖，是健康食品中一种常见的有效成分，具有免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、降血压、抗血栓、降血糖、抗辐射以及保护免疫性肝损伤等功效。

在生产过程中，常需对多糖的含量进行测量和监控。

但由于多糖不是一种纯粹的化学物质，而是由10个以上相同或不同种类的单糖缩合而成的聚合糖高分子碳水化合物，可用通式(C6H10O5)n表示。

在形成多糖的过程中，由于单糖的种类、个数、连接方式等的区别，导致多糖存在形式多变、种类繁多，因此很难采用液相色谱法或气相色谱法测定其含量。

那多糖比较常用的检测方法有哪些呢？这些常用的方法存在哪些问题？下面完美公司就给大家一一道来，多糖检测技术是如何为完美产品保驾护航的！

目前常用的检测方法

苯酚-硫酸法

在多糖的定量分析中，苯酚-硫酸法是被广泛应用的方法之一。

如NY/T 1676-2008、SN/T 4260-2015、QB/T 5176-2017、GB/T 18672-2014、GB/T 40632-2021、DB45/T 2143-2020、DB22/T 2274-2015、DB22/T 1685-2012及2020年版《中国药典》项下铁皮石斛、金樱子和枸杞子等标准中多糖的测定均为苯酚-硫酸法。

其原理是多糖在浓硫酸作用下水解成单糖并迅速脱水生成糠醛衍生物，与苯酚缩合成橙黄色化合物，以葡萄糖等为标准品，用紫外分光光度计测定吸光度值与糖浓度的线性关系，进而对样品进行定量。

该方法操作简单、快速，显色后稳定性较好，但存在有时测定结果精密度较差、标准曲线的R2偏低和有色样品结果易偏高等问题，相关原因及解决方法见表1。

表1 苯酚-硫酸法易出现的问题及解决方法

蒽酮-硫酸法

DB12/T 884-2019及2020年版《中国药典》项下百合、灵芝及黄精等标准中多糖的测定均为蒽酮-硫酸法。

其原理是多糖在浓硫酸作用下水解成单糖并迅速脱水生成羟甲基呋喃甲醛（羟甲基糠醛），与蒽酮缩合成蓝绿色化合物，以葡萄糖等为标准品，用紫外分光光度计测定吸光度值与糖浓度的线性关系，进而对样品进行定量。

该法几乎可以测定所有的碳水化合物，但显色时样液的取样体积、蒽酮试剂中硫酸的浓度、蒽酮试剂的用量、沸水中反应的时间这几个操作条件之间是有联系的，且显色后颜色的深浅随温度条件和加热时间而变化，因此，该方法的重复性及稳定性较差。

若采用此法测定多糖含量，控制反应条件很重要，否则会影响分析结果，且蒽酮试剂宜新鲜配制。

此外，样品中若色氨酸含量较高，对显色反应会有一定的干扰。

碱性酒石酸铜滴定法

该法的原理是样品中的多糖经酸解后，全部转化成还原性单糖，在加热条件下直接滴定标定过的碱性酒石酸铜液，以亚甲蓝为指示剂，根据样品液消耗的体积计算还原糖含量，再乘以换算系数0.9即得多糖含量。

使用该方法时需注意以下几点：

1.亚甲蓝被糖还原为无色时即为滴定终点，但与空气接触后又被氧化为蓝色，因此一定要保持在微沸状态下（防止空气进入）滴定。

如可在加热板的一边放置石棉网，打开加热板，设置为最高温度，先将待滴定的锥形瓶放置在加热板上未放石棉网的一边迅速加热至沸（可在锥形瓶上盖上坩埚盖），再将锥形瓶移至另一边有石棉网的加热板上继续加热，以保证滴定时每个样品的热源强度尽可能一致，且便于终点的判断。

2.为了减少实验误差，除了热源强度外，锥形瓶的规格（如统一选用150mL的锥形瓶）、加热时间、滴定速度、终点判断等也应尽可能一致。

3.标定时，加热至沸后，葡萄糖对照品溶液的用量必须控制在0.5～1.0mL之间，平行滴定的体积差不超过0.1mL，否则应重复滴定。

4.当健康食品中多糖含量太低或水解后溶液颜色太深影响终点观察时，可采用回滴法。

但在正式滴定前，一定要进行预测，以确定加入葡萄糖溶液的量。

正式滴定时，需将滴定所需体积的绝大部分先加入碱性酒石酸铜溶液中共沸，使其充分反应，仅留1mL左右作为滴定终点的判断。

多糖检测应注意的问题

上述几个方法是目前常用的测定健康食品中多糖的方法，但是容易存在以下几个问题：

取样

健康食品大多为胶囊，内容物呈粉状或颗粒状，所以取样时至少要取20粒样品，全部倒出后混匀，应研磨成细粉，再用标准筛筛取，保证样品均匀、具有代表性，使结果更精确。

样品中有无淀粉、糊精的判定

若样品中含有淀粉或糊精等物质，这些物质也会水解成多糖，从而使多糖检测结果偏高。

因此若不能确定样品中是否含有淀粉或糊精，在预处理过程中，可用碘液检验，观察样液是否与碘溶液反应而呈现蓝色或红色。

若显蓝色则应加入α-淀粉酶及糖化酶处理，若显红色则应加入糖化酶处理。

处理的原则是将这类非活性多糖的碳水化合物全部酶解，再用乙醇沉淀所需要的活性多糖以达到分离的目的。

脂肪的影响

脂肪的存在会妨碍酶对淀粉的作用及可溶性糖类的去除，因此应用乙醚脱脂，如样品中脂肪含量较少，则可省略此步。

方法的选择

一般来说，比色法的优点是灵敏度高（可达μg/mL），样品用量少，但缺点是测定时常使用葡萄糖做对照品，误差较大，理论上需用被测物的纯品作对照品，但制备被测物的纯品并非每个实验室都能做到，且健康食品又由多种中草药制成，多糖种类不一，更增加了获得纯品的难度。

所以当成品中多糖含量大于1%（质量浓度）时，最好选用碱性酒石酸铜滴定法；不过在能获得样品中所含多糖的纯品作对照品时，可用色谱法进行分离检测。

随着健康食品市场的扩大，对于多糖的关注度也越来越高，但是由于多糖成分复杂、结构多样化，如何寻得一个比较合理、覆盖范围较广的方法是值得深入研究和探索的课题。

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